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【从植物材料或植物培养细胞中提取***组DNA】

① 按下表称取适量的新鲜植物材料（如选用的是冷冻干燥植物材料，则用量减半），剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。

植物材料使用量 植物花、叶片10～100 mg 植物茎60～240 mg 植物根80～240 mg 植物种子80～240 mg   如选取植物的根、种子等样品时，因其***组DNA含量很低，需使用超过表格中所示的参数用量，此时请分两管进行步骤1～6的实验操作，在步骤7的操作中再将各管溶液分次加入至同一Spin Column中过滤，使各管的***组DNA结合到同一个Spin Column上。如从培养的植物细胞中提取***组DNA，请离心收集2×103～1×107的培养植物细胞，加入150 μl水充分悬浮细胞后移入研钵中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末状。

注）样品研磨应充分，否则将会严重影响***组DNA的收率。

② 将研钵移至65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1，用力碾磨30秒。

③ 收集650 μl研磨好的***匀浆移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650 μl，请补充Solution A至650 μl。65℃保温15分钟。注）处理富含纤维的根/茎等植物材料或富含淀粉、蛋白质的种子等时，可延长水浴时间至60分钟。

如何确认RNA的质量

实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估***的活力。RNA样本提取的质量直接影响***表达分析。影响RNA品质的因素有以下三种：RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。

检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：

紫外分光光度计法：

测量260nm吸收值计算RNA浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估RNA纯度。需要注意的是：在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。

260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明RNA可能发生降解。

琼脂糖凝胶电泳：

完整的RNA通常有三条带，***亮的是28S条带，其次是18S条带，***淡的是5S条带（部分***盒提取时会过滤掉5S条带）。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。

如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利，28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量***好。

若RNA条带出现弥散，原因可能：RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。

回收产物的检测

1.紫外分光光度计法检测DNA在OD260处有明显吸收峰，当OD260=1时，相当于大约50 ng/μL双链DNA、40 ng/μL单链DNA。OD260/OD280≈1.6~1.9时，说明DNA纯度较高。若洗脱时不用洗脱缓冲液，而是用去离子水，会使比值偏低，因为离子的存在会影响吸光度。但不表示纯度低。

2.SYBR法检测取回收产物1 μL，与1 μL SYBR染料混匀，于荧光透1视仪下观察是否有黄绿色荧光。

3.琼脂糖凝胶电泳法检测取回收产物5 μL，与10×Loading Buffer混匀，DNA Marker加5 μL，电泳后凝胶成像观察。5 μL DNA Marker相当于每个条带50 ng DNA，观察目的条带亮度大致为Marker的两倍，则大致估算其浓度约为20 ng/μL。

为什么用无水乙醇沉淀DNA

　　用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中较常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶， 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

　　DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的***终含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。

　　但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵， 后面的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙1醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。