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发布时间:2022-03-24 02:19:41
核糖核酸(缩写为RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A(腺piao呤)、G(鸟piao呤)、C(胞***H4N2)、U(尿***H4N2),其中,U(尿***H4N2)取代了DNA中的T。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
***一个细胞含RNA约10pg(含DNA约7pg)。与DNA相比,RNA种类繁多,分子量较小,含量变化大。RNA可根据结构和功能的不同分为信使RNA和非编码RNA。非编码RNA分为非编码大RNA和非编码小RNA。非编码大RNA包括核糖体RNA、长链非编码RNA。非编码小RNA包括转移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA(20~300nt)包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等,***也有小分子RNA(50~500nt)。
总RNA的抽提方法:
目前常用的方法是用异硫qing酸胍苯1酚抽提法。
提取步骤:
先用液氮研磨材料,匀浆,加入Trizol***,进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯1仿抽提,离心,分离水相和有机相,收集含有RNA的水相,通过异丙1醇沉淀,获得比较纯的总RNA,用于下一步mRNA的纯化。也可将含有RNA样品的细胞破碎液通过硅胶膜纯化柱纯化。
RNA浓度和纯度判断:
OD260为1时相当于浓度为50 ug/mL;
OD260/0D280值在1.8~ 2.0之间,表示纯度较好;
0D260/OD280值低于1.8,样品有蛋白质或酚污染;
0D260/0D280值大于2.0,提取的RNA可能有降解;
电泳后如果rRNA大小完整,而且28S rRNA和18SrRNA亮度接近2:1、mRNA分布均匀,则认为RNA。
提取DNA常用的方法
一.酚抽提法:先用蛋酶K、SDS破碎细胞,消化蛋白,然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb
二.甲酰胺解聚法:破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
三.玻璃棒缠绕法:用盐酸胍裂解细胞,将裂解物铺于乙醇上,然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅,DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
四.异丙1醇沉淀法:基本同1法,仅用二倍容积异丙1醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在异丙1醇中可溶状态)
五.表面活性剂快速制备法:用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞,然后用蛋白酶K或酚去除蛋白,乙醇沉淀或透析。
六.加热法快速制备:加热96℃-100℃,五分钟,然后离心后取上清,可用于PCR反应。
七.碱变性快速制备:先用NaOH作用20分钟,再加HCI中和,离心后取上清,含少量DNA。
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