病原菌检测常用指南「友名生物」

EXBio的T淋巴细胞增殖反应检测***盒（T-cell BlastoFlowEx Kit）#ED7642 旨在测量活化的全血样本中T淋巴细胞的增殖反应。 该***盒使用抗CD3和抗Ki67抗1体混合物检测增殖的淋巴细胞。

T淋巴细胞增殖反应检测***盒实验流程：

1.从培养箱中取出试管，取下并丢弃管盖。每管中加入25 ul EDTA溶液，混合。

2.在37℃下孵育10分钟。

3.加入2ml的PBS，混合。400g离心细胞5分钟，移除上清液。

4.轻轻摇动管子扰乱沉淀。加入2ml的稀释固定和裂解溶液，混合。室温下孵育10分钟。

5.400g离心细胞5分钟，移除上清液。

6.加入0.5ml稀释的破膜溶液，混合。室温下孵育10分钟。

7.加入2ml的PBS。400g离心细胞5分钟，移除上清液。

8.加入50 ul的CD3/Ki-67 PE抗1体预混液，混匀，室温下孵育至少30分钟。

9.加入2ml PBS。400g离心细胞5分钟，移除上清液。

10.用0.1-0.3ml的1％甲醛PBS溶液或者稀释的固定和裂解液（1份固定裂解液液+9份PBS的缓冲液）重悬细胞。在2-8℃下暗室条件下储存处理后的样品，直到分析。

【从植物材料或植物培养细胞中提取***组DNA】

① 按下表称取适量的新鲜植物材料（如选用的是冷冻干燥植物材料，则用量减半），剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。

植物材料使用量 植物花、叶片10～100 mg 植物茎60～240 mg 植物根80～240 mg 植物种子80～240 mg   如选取植物的根、种子等样品时，因其***组DNA含量很低，需使用超过表格中所示的参数用量，此时请分两管进行步骤1～6的实验操作，在步骤7的操作中再将各管溶液分次加入至同一Spin Column中过滤，使各管的***组DNA结合到同一个Spin Column上。如从培养的植物细胞中提取***组DNA，请离心收集2×103～1×107的培养植物细胞，加入150 μl水充分悬浮细胞后移入研钵中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末状。

注）样品研磨应充分，否则将会严重影响***组DNA的收率。

② 将研钵移至65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1，用力碾磨30秒。

③ 收集650 μl研磨好的***匀浆移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650 μl，请补充Solution A至650 μl。65℃保温15分钟。注）处理富含纤维的根/茎等植物材料或富含淀粉、蛋白质的种子等时，可延长水浴时间至60分钟。

RNA***盒注意事项

所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。

RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯，需电泳检测。

使用时一定要根据自己的实验需要购买专1用提取***盒， 如果不是专1用***盒，或许能提出RNA，但不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RT PCR、芯片分析、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析、分子克1隆等后续实验的结果。

当前提取效果好的是RNA提取***盒，但其售价较高，单次实验费用花费太大，对精度要求不高的实验没有必要购买，当然还有其它的进口***盒，但是均存在价格高、订货周期长的问题（如果碰上国内无货的时候，要从国外发货，会等很长一段时间）。普通的提取实验用国产的***盒就足以，价格不高，基本上各地均有现货，如天根（国内生产的***盒中销售面比较广的一种）等，其价格比进口***盒要便宜许多，且效果还不错，还可以

为什么用无水乙醇沉淀DNA

　　用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中较常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶， 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

　　DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的***终含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。

　　但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵， 后面的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙1醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。