植物转***载体承诺守信 友名生物

　　植物的遗传转化是以植物器1官、***、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源***，获得外源***稳定表达的可育植株。遗传转化可以打破物种界限，有目的地实现物种之间或物种内部遗传物质的交流，为植物的遗传改良开辟了一条新的途径。

　　植物遗传转化方法就是通过特定的方式将外源***导入到受体细胞内，使之发生定向的遗传变异。目前，已经建立了多种转化系统。对于大多数遗传转化系统而言，遗传转化方法是遗传转化系统的关键环节，决定着转化的成败及效率。用于植物的遗传转化方法有许多：农杆1菌介导法、***枪法和PEG法等。

　　在转0***植物中，用农杆1菌介导法获得的转0***植物占80%，但大多集中在双子叶植物上。自从***枪问世以后，单子叶植物中的禾谷类作物的遗传转化获得了迅速发展。农杆1菌介导法和***枪法已成为目前用于遗传转化的主要方法。

典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒***组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13/的HCMV IE启动子－多克1隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源***的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1***缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力必须的蛋白IX的***），也保留了腺病毒的包装信号

φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒***组的绝大部分，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1***的人胚shen细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能copy，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分***组，同样不能copy。外源目的***插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野1生型腺病毒相似，具有同样的感1染力进入靶1细胞的能力，但是***组DNA的E1区被外源目的***取代，即进入靶1细胞后病毒不能copy，但可以表达目的蛋白。

腺病毒表达

   腺病毒系统是很受欢迎的可以在任何哺乳动物细胞中有效瞬时表达的***递送平台。对于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送外源***的方式是非常有效的选择。钟鼎生物采用293A腺病毒包装细胞系（含有腺病毒包装所必需的E1***序列，是专为生产腺病毒和进行滴度测定而建立的），用于高滴度的copy缺陷型（E1和E3缺失）腺病毒的生产，以进行外源***的表达。腺病毒感1染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感1染的淋巴1瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞***表达的***佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比；不整合到染色体中，无插入致突变性。能有效进行增殖，滴度高：腺病毒系统可产生108 pfu/ml原液，浓缩后可达1010-1011 VP/ml，这一特点使它非常适用于***cure。

腺病毒分离与鉴定

1．分离培养 标本应尽早从感1染部位采集。采集患者咽喉、眼分泌物，粪便和尿液等，加抗1生素处理过夜，离心取上清接种敏感细胞（293、Hep-2或HeLa细胞等），37℃孵育后可观察到典型CPE，即细胞变圆、团聚、有拉丝现象，较突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄串状。

2．病毒鉴定 用荧光标记的抗六邻体抗1体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，也可用血凝***（hemoagglutination inhibition，HI）试验或中和试验（neutralization test）检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血1清型。腺病毒可用Shell vial技术进行快速鉴定。病毒标本经抗1生素和离心处理，取上清接种于有细胞的Shell vial培养瓶，孵育1～2天，用特异性六邻体单克1隆抗1体对其抗原表位进行检测。也可用病1人鼻粘膜上皮脱落细胞直接染色检测病毒抗原。用DNA杂交或内切酶酶切等鉴定分离培养的病毒DNA；PCR可用于腺病毒感1染的诊断，引物设计主要根据腺病毒六邻体、VAI和VAII编码区序列，能检测所有血1清型，而且其敏***很高，能检测某些patient潜在的腺病毒。用腺病毒41型BgIII-D片段作探针诊断腺病毒腹泻，其检出率可达80%。