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植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：

1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。

2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ＣＴＡＢ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。

3 取出离心管,冷却至室温,加入氯1仿/异戊1醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。

4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ＣＴＡＢ和等体积的氯1仿/异戊1醇。充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。

5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ＣＴＡＢ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ＤＮＡ絮状沉淀。1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。

6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中过夜。待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。

7 将风干的ＤＮＡ直接在4℃保存备用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。

适用于ＰＣＲ研究的快速提取法：

1 田间剪取植株新鲜叶片5-10ｍｇ(约2ｃｍ长)左右,新鲜叶片放于1 5ｍｌ离心管中,存于冰盒中,根据样品号贴上相应的标签。

2 用剪刀将叶片***剪细(约0 5ｃｍ长)放在点穴式研板中。

3 加入400μｌＤＮＡ提取缓冲液,用玻棒将叶***研细,直到液体变成深绿色即可。

4 再加400μｌＤＮＡ提取缓冲液,混合均匀,转入一新的1 5ｍｌ离心管(贴上相应的编号)。

5 加400μｌ氯1仿,混合均匀后,2400×ｇ离心30ｓ,将上清液转入一支新的1 5ｍｌ离心管(贴上相应的编号)。

6 加800μｌ无水乙醇,混匀,2400×ｇ离心3ｍｉｎ。弃上清。

7 70%乙醇冲洗,风干。

8 用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃。

9 取1μｌ用于ＰＣＲ分析。

棉花等酚类、多糖类物质较多的植物ＤＮＡ提取法：

1 取2ｇ新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ｍｌ离心管中。

2 在50ｍｌ离心管中加入10ｍｌ冰预冷的提取缓冲液,在涡悬振荡器上充分混匀。

3 于4℃,2700×ｇ离心20分钟,倒去上清液。

4 在沉淀中加入5ｍｌ裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充分混匀。

5 于65℃水浴锅中温育30ｍｉｎ。

6 加入5ｍｌ氯1仿/异戊1醇(24/1),并上下翻转以充分混合。

7 于4℃,2700×ｇ离心5分钟。

8 转移上层水相至一新的50ｍｌ离心管中。

9 重复步骤7-9一次。

10 加入2/3体积的冰预冷的异丙1醇,并上下翻转以充分混合,至-20℃2ｈ。

11 于4℃,1200×ｇ离心10ｍｉｎ。

12 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液,用玻棒将ＤＮＡ转入该管(如不能直接用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍｉｎ后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干燥。

13 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入终浓度为20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,过夜。

14 风干,用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃备用。

用乙醇沉淀DNA时为什么一定要加NaAc或N***

　　在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或N***，使Na+中和DNA分子上的负电荷， 减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时， 只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

　　加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理?

　　加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、*抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

　　在***操作实验中，磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。