逆转录病毒滴度测定咨询*** 友名生物技术

腺病毒是无胞膜的线性双链DNA病毒，目前腺病毒科分为5个属，有多种型别的腺病毒已经被开发为***转移载体，在基础科研、***cure和载体疫1苗领域得到广泛应用。

腺病毒的***组长约26-46kb，这使得腺病毒载体的构建与常见质粒载体(一般长度小于10kb)不同。太长的***组使得在腺病毒载体上富集一个多克1隆位点非常困难。针对重组腺病毒的构建，开发了多种方法。

目前已有的腺病毒载体系统均存在缺陷，有些构建步骤繁琐，耗时较长，有些在重组病毒中引入了不必要的外源序列，有些不能用于重组腺病毒的反向遗传改造。近年来，新的生物特性不同的腺病毒不断被发现，因此，本领域对构建过程更加快捷简便的、人工改造更加方便灵活的腺病毒载体系统和重组病毒构建方法存在需求。

真核细胞同源重组法

1994 年，Graham F建立了在293细胞同源重组产生重组腺病毒的方法。这个方法需要2个质粒：骨架质粒含有腺病毒绝大部分***组序列，但不含有包装信号；穿梭质粒含有ITR、包装信号和目的***克1隆位点，以及两段与骨架质粒有重叠的序列。将目的***克1隆到穿梭质粒，与骨架质粒共转染293细胞，由于这两个质粒的部分序列有重叠，能够在细胞内发生同源重组，***终产生完整的载体***组，并包装出重组病毒颗粒。该方法曾经被广泛使用，推动了腺病毒载体的发展。由于细胞内重组效率低，某些重组事件还可能产生可copy病毒(RCV)，必需经过噬斑纯化才能获得正确的克1隆化的重组病毒，费时费力，正逐渐被其他方法替代。

腺病毒的结构

腺病毒含13%DNA和87%的蛋白质，病毒体分子量约为175×106。病毒***组为线状双链DNA，大约含35kb～36kb，腺病毒12、18和31型的DNA组成中，G+C mol%***低（48%～49%），属于对动物具有高致***性***型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol%较高（61%），致***性反而低或无。这是一种用于人腺病毒分离株的分组的标准，根据其***同源性将人腺病毒分为A～F等6组。

***导入细胞常用方法

不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。

由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，***ery等就发现***肺1炎双球菌的DNA与***肺1炎双球菌共培养后产生***性的肺1炎双球菌后代的转化现象。但DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和***工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆1菌经冰冷C***2的处理，就成为感受态***，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入***；用高电压脉冲短暂作用于***也能显著提高转化效率，这称为电穿孔（electroporation）转化法