反转录预混液来电咨询 友名生物

PCR反应特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶***的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶***片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶***区，其特异性程度就更高。

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR***经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：

  （1）标本对照：被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照；被检的标本是***细胞就用相应的***细胞作对照。

  （2）***对照：在PCR***中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测***是否污染。

3、重复性试验。

4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。

等位***特异性PCR(Allele- specificPCR. ASPCR技术

ASPCR依赖于引物3”-端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物.可用于检测***点突变。

单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphi*** PCR, ***PPCR)技术

***P- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙1烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测***变异。在不含变性剂的中性聚丙1烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空间构象。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置.靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时.就会出现泳动变位。从而提示该片段有***变异存在。

原位PCR( in situ PCR)技术

原位PCR综合了PCR和原位杂交( Insitu hybridization, ISH)的优点是一种在***切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增.再用特异性的探针原位杂交检测。原位PCR标本一般需先经化学固定,以保持***细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜有一定的通透性,PCR扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内。在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织，不易透过细胞膜向外弥散，故保留在原位。这样就很容易应用ISH将其检出,同时还可对目的DNA序列的***细胞进行形态学分析。