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DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，及在将其连接到载体上

这三个连续的步骤在连接酶的三个不同域进行，与双链DNA接触的各个域环绕DNA底物形成反应域。DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，以及在分子克1隆前将其连接到载体上。

用于分子克1隆的DNA连接酶是***来源或者噬菌体编码。所有真***，无论是嗜热或嗜温，包含一个单一的连接酶***，编码NAD*-依赖型的酶(Olivera and Lehman1967; Takahashi et al. 1984)。

在连接反应的第yi步中， 使用NAD的二磷酸作为磷酸1酐键和腺营基团转移到DNA连接酶赖氨酸残基的ε-氨基基团。腺苷酸残基然后转移到DNA底物的5-磷酰基末端，变得易于受到并列的3'羟基基团的亲核攻击。

这导致磷酸二酯键的形成，消去AMP,以及形成DNA链的共价连接。用于分子克1隆的DNA连接酶在连接非经典底物时能力有所不同，如平末端双链、DNA-RNA杂交体或单链DNA.这些以及其他的属性归纳于表5。分子克1隆中比较常用的催化体外连接的酶是T4噬菌体编码的DNA连接酶。

DNA连接酶的性质

噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所***。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆1菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆1菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

长***组序列、特别是包含大的***簇的那些的克1隆对于产生medicine和生物燃料的合成生物学和***工程工作特别重要。传统的基于PCR的克1隆方法通常受限于DNA模板的长度和GC含量：标准的PCR反应常规产生至多10 kb的片段，而更长的PCR产物需要反应条件的繁琐优化，并且甚至在理想条件下，通常受限于35 kb5。或者，可通过装配多个短片段，例如重叠PCR产物或化学合成的DNA寡聚物，产生长的目的***组序列，但这样的方法趋于耗时和昂贵，特别是对于获得长于50 kb的序列(其通常需要3-5阶段，每个包含多个装配事件)6,7。获得长的***组序列的另一方法是通过***组DNA的限制性酶消化。