PCR预混液常用指南 武汉友名生物

LA PCR的原理

LA PCR的关键是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐热性DNA聚合酶。在PCR过程中当有错误的碱基摄入时，反应性能将大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可将错配的碱基除去，从而延伸反应能顺利地进行下去，使长链DNA的扩增成为可能。

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

等位***特异性PCR(Allele- specificPCR. ASPCR技术

ASPCR依赖于引物3”-端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物.可用于检测***点突变。

单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphi*** PCR, ***PPCR)技术

***P- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙1烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测***变异。在不含变性剂的中性聚丙1烯酰胺凝胶中,单链DNA迁移率除与DNA长度有关外,更主要取决于DNA单链所形成的空间构象。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置.靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时.就会出现泳动变位。从而提示该片段有***变异存在。

PCR有哪些应用领域？

***表达

通常可通过PCR来检测不同细胞类型、***和生物体在特定时间点的***表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR。

终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化，然后对条带强度进行定量，并以管家***为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平。如今，终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了，因为它们可获得和的***表达定量结果。