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 PCR技术的基本原理

PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下.依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶.促合成反应。其具体反应分三步:变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一 循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板,数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的copy，经25~ 30次循环DNA数量可达2x1067拷贝数。

锚定PCR(Anchored PCR. APCR技术.

用酶法在一通用引物反转录cDNA3'-末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR.应用:它可用于扩增未知或全知序列，如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR术

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁侧序列的一种方法，主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化***组DNA.后酶切片段自身环化.以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA的部分片段，大小取决于.上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。

该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核***组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Co***id中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个***序列杂交。

低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PGR)技术

LSSP - PCR是建立在PCR基础上的又一种新型***突变检测技术。要求是“二高一低”。高浓度的单链引物( 5-端/ 3-端引物均可).约4. 8Lmol高浓度的Taq酶( 16Lmol/ 100ml) 低退火温度( 300.所用的模板必须是纯化的DNA部分片段。在这种低严格条件下。引物与模板间发生不同程度的错配。形成多种大小不同的扩增产物。经电泳分离后形成不同的带型。对同一目的***而言。所形成的带型是固定的。因而称之为“***标签”。这是一种检测***突变或进行遗传鉴定的快速敏感方法。